突破性进展！中国学者报道脐带血CAR-NK治疗复发/难治性大B细胞淋巴瘤的Ⅰ期临床和转化医学数据
嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法已被证实对血液系统恶性肿瘤具有显著疗效，并且异体CAR-T细胞也在临床试验中展现出良好的应用前景；然而，异体CAR-T细胞存在诸多局限性，例如其可能引发高风险的移植物抗宿主病(GvHD)，并易被患者免疫系统快速清除。自然杀伤(NK)细胞不引发GvHD风险，且具备作为“即用型”细胞产品的标准化生产潜力，使其成为下一代癌症免疫治疗的理想候选者。相较于CAR-T疗法，CAR修饰的NK(CAR-NK)细胞具有更优的安全特性，并通过CAR依赖性和非依赖性机制增强肿瘤杀伤活性。
在临床前研究中，CAR-NK细胞已展现出对抗多种恶性肿瘤的显著活性，目前多项临床试验正在进行中。截至2024年6月，ClinicalTrials.gov已注册94项研究，旨在评估不同类型CAR-NK治疗策略的安全性和有效性。然而，大多数试验结果尚未公布，仅少数研究发表，且纳入患者数量有限。
2025年4月，《Nature cancer》杂志发表了一篇题为“Safety and feasibility of 4-1BB co-stimulated CD19-specific CAR-NK cell therapy in refractory/relapsed large B cell lymphoma: a phase 1 trial”的文章，该文章报道了中国学者浙大附二院钱文斌教授团队利用狒狒包膜假型慢病毒载体(BaEV-LV)从脐带血制备CD19特异性CAR-NK细胞的成果。该抗CD19 CAR结构包含FMC63 scFv及4-1BB和CD3ζ信号内结构域(CD19-BBz CAR)，并转导表达sIL-15。临床前研究证实，CD19-BBz CAR-NK细胞在体内外均对B细胞淋巴瘤展现出强大的抗肿瘤活性。随后开展了一项Ⅰ期临床试验，纳入复发或难治性大B细胞淋巴瘤(LBCL)患者，接受三剂方案的CD19-BBz CAR-NK细胞治疗，并评估其临床安全性和疗效。此外，通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术，对不同治疗结果患者的CAR-NK细胞产品及外周血免疫细胞进行了深入分析，进一步揭示了CAR-NK细胞治疗的耐药机制。“细胞知聊”本期将为您带来相关内容介绍。
研究结果
CD19-BBz CAR-NK细胞在淋巴瘤模型中展现强效抗肿瘤活性
4-1BB和CD3ζ结构域是NK细胞天然用于信号传导和激活的关键元件。因此，研究团队构建了一个串联式CAR结构，包含4-1BB/CD3ζ激活域(图1a)。该CD19-BBz CAR还携带了白细胞介素-15(IL-15)转基因，并通过BaEV-LV进行转导。通过荧光标记蛋白Venus的表达以及CD19-CAR蛋白的表面表达(图1b)，证实了脐带血来源的NK细胞具有较高的转导效率，平均54.95%的NK细胞成功表达CD19-CAR。
在体外实验中，CD19-BBz CAR-NK细胞对Raji和Jeko-1淋巴瘤细胞的杀伤能力显著优于未转导的NK细胞(图1c)。为验证其体内抗肿瘤效果，将JeKo-1细胞静脉注射至NSG小鼠体内。3天后，每只小鼠通过尾静脉接受单剂量(2×10^5)的CD19-BBz CAR-NK细胞或claudin18.2特异性CAR-NK细胞(18.2-BBz CAR-NK，同样表达IL-15)。与体外实验结果一致，CD19-BBz CAR-NK细胞展现出最强的肿瘤杀伤能力。接受CD19-BBz CAR-NK细胞治疗的7只小鼠中，有5只在治疗后至少46天仍保持无瘤状态，显著优于未修饰NK细胞或18.2-BBz CAR-NK细胞治疗组(图1d-f)。
图1，CD19-BBz CAR-NK细胞展现出强效的抗肿瘤活性(a-f)。
为评估CD19-BBz CAR-NK细胞在体内的存续和浸润情况，在治疗后第46天分析了小鼠骨髓、血液和脾脏中的CAR-NK细胞数量。结果显示，所有样本均检测到CAR+ NK细胞(图1g)。在骨髓、血液和脾脏中，肿瘤阴性人类移植物（标记为hCD45+GFP−）中CAR+细胞的平均百分比分别为94.38%、92.07%和95.05%。此外，与未转导NK细胞相比，CD19-BBz CAR-NK细胞和18.2-BBz CAR-NK细胞在第22天仍能分泌更高水平的IL-15(图1h)。
这些数据表明，CD19-BBz CAR-NK细胞的长期存续能力和肿瘤浸润特性可能显著增强其体内抗淋巴瘤疗效。
图1，CD19-BBz CAR-NK细胞展现出强效的抗肿瘤活性(g,h)。
临床试验设计与入组患者
本试验在浙江大学医学院附属第二医院(杭州)开展，自2022年7月至2022年12月，按照研究方案纳入了9例经预筛选的复发/难治性大B细胞淋巴瘤(LBCL)患者。这些患者均接受了化疗预处理方案，但其中1例因活动性感染未接受CAR-NK细胞输注，并被排除在后续所有分析之外。
图2，临床试验流程图及CAR-NK细胞制备工艺流程图
患者接受由环磷酰胺(750 mg/m^2/天，第-5天至第- 3天)和氟达拉滨(30 mg/m^2/天，第-6天至第-3天)组成的淋巴细胞清除化疗。不允许在输注后进行任何桥接治疗或其他抗肿瘤治疗。在第0天、第7天和第14天，患者分别接受CD19-BBz CAR-NK细胞输注。三个剂量组分别为2×10^6/kg、3×10^6/kg和4×10^6/kg CAR-NK细胞。
接受每周一次、连续三剂CD19-BBz CAR-NK细胞治疗的患者的基线特征见表1。患者接受CAR-NK细胞输注时的中位年龄为67岁(范围：48-73岁)。所有患者均接受过重度前线治疗，既往治疗线数中位数为5(范围：3-8)，包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL，6例)、转化型滤泡性淋巴瘤(tFL，1例)及套细胞淋巴瘤(MCL，1例)。多数患者(62.5%)为Ⅲ-Ⅳ期疾病，87.5%存在结外受累，62.5%乳酸脱氢酶(LDH)水平升高，87.5%国际预后指数(IPI)评分为中高危。值得注意的是，其中3例患者既往接受过CD19 CAR-T细胞治疗。入组前不允许进行抗淋巴瘤的桥接治疗，且在治疗后第30天评估前禁止进行缓解后治疗，除非确认疾病复发或进展。制备的CD19-BBz CAR-NK细胞产品的工艺流程及特性见图2b。
表1，患者基线特征
CD19-BBz CAR-NK细胞疗法的安全性良好
对所有患者发生的任何级别不良事件(无论原因)进行了评估。值得注意的是，该研究未观察到剂量限制性毒性(DLTs)，也未达到最大耐受剂量(MTD)。与既往MD Anderson的研究一致，9例患者中均未发生细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性事件。此外，尽管患者与CAR-NK供者之间存在人类白细胞抗原(HLA)错配，但未观察到GvHD。
血液学毒性是与CAR-NK治疗相关的最常见不良事件，所有患者均出现3-4级白细胞减少症。其中，3例(37.5%)患者发生3级发热性中性粒细胞减少症，4例(50%)患者发生3级血小板减少症。值得注意的是，未出现CAR-T疗法中常见的长期或延迟性血细胞减少现象。除血液学毒性外，少数患者报告了1级非血液学不良事件，包括便秘、恶心和皮疹(表2)。
表2，所有8名接受治疗的患者中不良事件情况
CD19-BBz CAR-NK细胞治疗的临床疗效
在所有患者中，于输注后第30天评估了客观缓解情况。客观缓解率(ORR)为62.5%(5/8)，其中4例(50%)达到完全缓解(CR)。至第30天，有2例患者出现疾病进展(PD)的证据(图3a)。值得注意的是，CAR-NK细胞剂量或治疗产品中CAR+细胞的比例均与临床疗效无关。
本研究的中位随访时间为25个月(范围：4-28个月)。中位无进展生存期(PFS)为9.5个月(图3b)，而研究结束时中位总生存期尚未达到(图3c)。在5例获得缓解的患者中，3例不幸因疾病进展死亡，其余2例维持持久缓解(图3d)。图3e展示了这5例缓解患者(包括CR和部分缓解者)治疗前后的正电子发射断层扫描-计算机断层扫描(PET-CT)影像。综合这些数据表明，多剂次CD19-BBz CAR-NK细胞治疗可产生强效且持久的抗肿瘤效应。
图3，CD19-BBz CAR-NK细胞治疗的临床疗效。
CD19-BBz CAR-NK细胞的药代动力学
早期扩增与持久性可能是CAR-T细胞在B细胞淋巴瘤患者中实现持久缓解的关键因素。因此，通过流式细胞术检测了所有患者输注后血液中CD19-BBz CAR-NK细胞的体内扩增情况。患者在CAR-NK治疗后4至7天出现细胞数量峰值，但不同患者的CAR-NK细胞计数存在差异(图4a)。通过数字液滴聚合酶链反应(ddPCR)分析检测了CAR拷贝数。
在获得缓解的患者中观察到CAR-NK细胞的增殖及更长的持久性。其中，1例达到CR的患者表现出低水平但长期的CAR-NK细胞持续存在，在治疗后15个月的外周血中仍可检测到CAR拷贝；另1例PR患者在治疗后第180天显示出高水平的CAR DNA拷贝。
然而，在无应答患者中，输注后2周即未检测到CAR拷贝(图4b)。
图4，CD19-BBz CAR-NK细胞的扩增和持续存在。
CD19-BBz CAR-NK细胞治疗的血清细胞因子谱
CRS的特征是由活化的免疫细胞产生的多种细胞因子和免疫调节因子(如IL-6和干扰素-γ [IFNγ])引发的炎症反应。CD19-BBz CAR-NK细胞的血清细胞因子谱与抗CD19 CAR-T细胞疗法有所不同，在少数患者中仅观察到嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)、IL-18、IL-1RA、IL-7、IFNγ诱导蛋白-10(IP-10)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP1α)、MIP1β、C-C基序趋化因子配体5(RANTES)和基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)的水平略有升高(图5a)。然而，在CAR-NK细胞输注后4周内，34种细胞因子中有24种保持在基础水平(图5b)。炎症和凝血病标志物(包括C反应蛋白、铁蛋白和D-二聚体)未观察到显著变化(图5c)。
图5，从患者获得的血清中细胞因子、炎症标志物和凝血病的变化。
输注产品及外周血单核细胞的转录组分析
进一步对两名经CD19-BBz CAR-NK细胞治疗后达到CR的患者和两名PD患者体内新鲜采集的CAR-NK细胞产品进行了scRNA-seq。此外，还纳入了三个经过冷冻保存并复苏的CAR-NK细胞产品(其中两个与CR相关，一个与PD相关)进行scRNA-seq分析。共鉴定出六个具有独特特征基因的NK细胞亚群(图5a、b)。达到CR患者的CAR-NK细胞产品中，NK4亚群细胞比例较高，而与PD相关的样本中则含有更多NK0亚群细胞(图5c)。有趣的是，冷冻保存后，高表达线粒体相关基因的NK3亚群比例显著增加(图5b、c)。通过分化潜能评分发现，NK4亚群的分化程度最低，其次是NK1和NK2亚群，而NK0亚群的分化程度最高/最为成熟(图5d)。NK1亚群中细胞增殖相关基因的高表达以及NK2亚群中DNA复制基因的高表达表明它们处于不同的增殖状态，而NK4亚群同时具备这两种特征，提示其处于增殖状态(图5e)。
图5，输注产品及外周血单核细胞的转录组分析(a-f)。
冷冻保存后，尽管经过数天的复苏，NK1、NK2和NK4亚群的比例均有所下降，而NK3亚群的比例则显著增加(图5c)。通过多种算法进行基因和通路富集分析显示，NK4亚群中NF-κB信号通路相关基因表达较低，而MHC II类基因表达较高；NK0亚群则呈现相反趋势(图5f)。此外，NK5亚群表达T细胞相关基因，其比例与性别显著相关，但与治疗效果无关(图5b、c)。
通过对与CR和PD相关的CAR-NK细胞产品之间的差异表达基因(DEGs)进行分析(图5g)，KEGG富集分析表明，与CR相关的样本中核糖体、抗原呈递和糖酵解信号通路富集，将其定义为“免疫潜能”基因集；而与PD相关的样本中细胞毒性通路和泛素化过程富集(图5g)，提示与PD相关的CAR-NK细胞产品中同时存在过早激活和耗竭状态。综合以上结果，建立了一个基于转录组的模型，通过评估耗竭、细胞毒性和免疫潜能水平来预测CAR-NK细胞产品的临床疗效(图5h)。
图5，输注产品及外周血单核细胞的转录组分析(g,h)。
为评估CAR-NK治疗对患者外周免疫细胞的影响，对3名达到CR的患者和2名PD患者在治疗后1周的外周血单个核细胞(PBMC)谱系进行了分析。在再生T淋巴细胞中，CD8-T细胞群占主导地位，而CD4-T细胞占比相对较小(图6a、b)。CR患者与PD患者在抗原呈递相关细胞和细胞毒性细胞的比例上存在显著差异(图6a、b)。为全面评估不完全肿瘤缓解的潜在障碍，将测序的PBMC分为三类——(1)抗原呈递细胞(包括各类单核细胞和树突状细胞)、(2)细胞毒性细胞(包括各类CD8-T细胞和NK细胞)以及(3)CD4-T细胞，并分析了它们在CR组和PD组间的DEGs以及基因集变异分析(GSVA)(图6c)。基于CR组与PD组之间平均delta评分的中位数(尽可能减少个体偏差)，发现“抗原呈递”细胞和“细胞毒性”细胞是驱动这五类基因表达差异的主要来源，而CD4-T细胞仅参与免疫抑制相关通路(图6d)。通过细胞类型特异性相关性分析，泛素化的作用范围更广：Casitas-B系淋巴瘤蛋白-b (CBLB)介导的泛素化不仅与抗原呈递显著相关，还与细胞毒性和免疫抑制密切相关；而糖酵解与脂质代谢在CD4-T细胞及大多数CD8-T细胞中未发生显著变化(图6e)。为验证泛素化对疗效的影响，额外收集了CR患者与PD患者的PBMC样本，发现CR患者PBMC中泛素E3连接酶CBLB的表达水平显著低于PD患者(图6f)。
图6，外周免疫细胞的单细胞转录组分析(a-f)。
在细胞间配体-受体通讯分析(Cell Chat)中，PD患者免疫系统的TGFβ信号通路(与免疫抑制及耗竭相关)显著增强，表明其免疫系统处于抑制状态，可能导致治疗失败；而CR患者NK细胞与单核细胞间的抗原呈递信号显著增强(图6g、h)，凸显宿主免疫状态对疗效的关键作用。
由于CBLB介导的泛素化与免疫抑制(TGFβ信号)呈正相关，但与MHC-II类抗原呈递及细胞毒性呈负相关，推测CBLB介导的泛素化可能是调控CAR-NK疗效的关键靶点，抑制该通路或可延长CAR-NK治疗的持久性。
图6，外周免疫细胞的单细胞转录组分析(a-f)。
研究结果表明，CD19-BBz CAR-NK细胞疗法具有可行性且治疗安全性良好，毒性较低，疗效显著并能维持长期缓解。
大量临床前研究已证实，采用不同共刺激结构域（如CD28-CD3ζ或4-1BB-CD3ζ结构域）的各种CAR分子构建的CD19 CAR-NK细胞具有良好疗效。本研究证实了通过BaEV-LV转导构建的CD19-BBz CAR-NK细胞的治疗效果。从机制上看，CD19-BBz CAR-NK细胞的持久性和浸润能力增强可能是其在体内表现出更强抗肿瘤疗效的原因。
基于临床前研究结果，开展了一项Ⅰ期临床试验，旨在评估对R/R LBCL患者多次输注CD19-BBz CAR-NK细胞的安全性和可行性。正如预期，该治疗安全性良好，未出现严重毒性反应，包括CRS、ICANS和GvHD。此外，在任何剂量水平下均未观察到DLT，因此未达到MTD。最常见的3级或以上不良事件是与淋巴清除化疗相关的骨髓抑制。
由于本研究采用剂量递增设计、样本量较小且纳入了多种B细胞恶性肿瘤亚型，研究结果具有探索性，需要在更大规模的队列中进一步验证。值得注意的是，一项评估推荐剂量[4 × 10^6 cells/kg] CAR-NK细胞（即Ⅰ期试验确定的剂量）的Ⅱ期剂量扩展研究正在进行中，以进一步评估疗效和安全性。
综上，研究证明了CD19-BBz CAR-NK细胞疗法通过重复给药治疗R/R LBCL的有效性。值得强调的是，该方法不会引发如CRS、ICANS或GvHD等严重毒性反应，使其成为一种安全且高效的异体CD19-CAR-NK细胞治疗选择。
参考文献：
[1] Aidan M. Tousley1, Maria Caterina Rotiroti
1. Lei W, Liu H, Deng W, et,al. Safety and feasibility of 4-1BB co-stimulated CD19-specific CAR-NK cell therapy in refractory/relapsed large B cell lymphoma: a phase 1 trial. Nat Cancer. 2025 Apr 18.
2. Chong, E. A., Ruella, M., Schuster, S. J. & Lymphoma Program Investigators at the University of Pennsylvania Five-year outcomes for refractory B-cell lymphomas with CAR T-cell therapy. N. Engl. J. Med. 384, 673–674 (2021).
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