Cell | Prime Editing又翻新，刘如谦团队进化出更高效的基因编辑器

先导编辑（Prime Editing，PE）是一种可以进行活细胞基因组编辑的基因编辑器，可以纠正绝大多数致病的基因突变。自开发以来已经更新到第5代（PE5）。

近期，博德研究所刘如谦（David R. Liu）团队对先导编辑器进行了进一步改进和优化，相关研究发表在Cell 期刊，题为“Phage-assisted evolution and protein engineering yield compact, efficient prime editors”。

该研究利用噬菌体辅助连续进化（PACE）技术，并通过进化和蛋白质工程技术来生成体积更小、效率更高的PE6a-g变体。将紧凑型逆转录酶的编辑效率提高了22倍，并产生了比最先进编辑PEmax少516-810个碱基对的先导编辑。还可以在双AAV递送后在小鼠大脑皮层中实现40%的loxP插入，与已有的最先进先导编辑器相比，提高了24倍。

研究模式图

先导编辑系统由两部分组成：一个是PE向导RNA，即pegRNA，包含向导RNA支架、指定目标位点的间隔体、与目标DNA互补的引物结合位点（PBS），以及编码所需编辑的逆转录酶模板（RTT）；另一个是由可编程酶和逆转录酶（RT）组成的先导编辑蛋白。

pegRNA复合物与目标基因组DNA的一条链配对，并切割另一条链，产生一个暴露的3’端与PBS结合。RTT与由此产生的引物-模板复合物结合，并启动RTT的逆转录。新合成的编辑DNA被整合到基因组中取代原来的DNA序列，在目标位置进行所需的编辑。

自PE系统开发以来一直在不断地改进，此前，研究人员已通过优化pegRNA、完善先导编辑器结构、改进细胞对PE编辑的反应以提高编辑效率。在本研究中，研究团队致力于PE系统的核心——逆转录酶RT。

PE系统概览图

研究团队调查了来自不同系统发育起源的RTs，并测试了跨越14类作为主要编辑器的59种酶，将这些编辑器与PE1、PE2和PE2△RNaseH（用于双重aav递送的PE2RNaseH截断形式）在HEK293T细胞中的三种编辑进行了比较。

这些结果显示尽管自然界中多种RT可以满足先导编辑，但它们的天然形式在哺乳动物细胞中介导PE效率较低，因此，需通过人为改造工程来解决所面临的问题。

团队决定采用噬菌体辅助连续进化（PACE）技术，这是刘如谦团队在2011年开发出的蛋白质定向进化方法。这种技术将生物分子的实验室进化和一种噬菌体的生命周期结合在一起，让蛋白质在每24小时内进化60轮。

在本研究中，他们开发出一种先导编辑PACE（PE-PACE）回路，将PE活性与噬菌体繁殖联系起来。通过对噬菌体基因进行PE编辑，模拟物竞天择的自然进化过程，经过数百小时的繁殖，对噬菌体进行达尔文进化选择，由此快速产生具有全新结构的逆转录酶。

先导编辑PACE选择的开发和验证

研究团队由此产生了一套新的编辑器：从PE6a到PE6g。经测试，PE6a和PE6b，其基因大小比M-MLV RT短516-810bp，PE效率最高；PE6c和PE6d具有高度活跃、双aav兼容的特性，对于一些难度较大的基因编辑，需要高度结构化的RTT，该系统优于PEmax；PE6e和PE6g中进化和改造的Cas9结构域可以提高某些特殊位点的PE效率。

在患者来源的成纤维细胞和人原代T细胞中，这些编辑器（PE6a-g）在治疗相关的编辑上都有所增强。

本研究RTs的成功进化跨越了4个不同的方面（即II类内含子，逆转录子，长末端重复逆转录转座子，逆转录酶病毒），实现了高效编辑、低索引和独特的DNA修复途径，PE6变体有望成为更有价值的体内编辑工具。

来源：基因编辑应用   侵删

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