江南大学研究团队创制出微生物“新一代碱基编辑器”，实现高效且大范围的碱基编辑

碱基编辑器(BEs)作为革命性的基因组操作工具被广泛应用于细胞进化。为了筛选目标个体，通常需要扩展编辑窗口，以确保变体库的高度多样化。然而，目前的BEs的编辑窗口有限，只有5-6个碱基，对应的只有2-3个氨基酸。

2024年4月11日，江南大学周哲敏团队联合韩来闯团队在Advanced Science 发表题为A New-Generation Base Editor with An Expanded Editing Window for Microbial Cell Evolution In Vivo Based on CRISPR‒Cas12b Engineering 的研究论文。论文中通过对CRISPR-Cas12b进行工程改造，开发了基于dCas12b的CRISPRi系统。在dCas12b的基础上，建立了具有扩展编辑窗口的新一代BEs，利用新BE获得实现微生物细胞（Bacillus subtilis和Escherichia coli）的高效且大范围的碱基编辑。

据报道，Cas12b在富含5'-t的PAM序列远端产生交错的7个核苷酸断裂。为了构建Bacillus subtilis Crispr - Cas12b辅助基因组编辑系统，构建了两个all-in-one (AIO)质粒，AaCas12b和BhCas12b，以sacA基因作为缺失并将质粒转化为Bacillus subtilis。AaCas12b的缺失效率较低，而BhCas12b的缺失效率为100%，表明BhCas12b比AaCas12b在枯草芽孢杆菌中具有更强的基因组编辑能力。为了进一步确定CRISPR-BhCas12b的稳定性，以基因aprE作为缺失的靶基因。结果显示，aprE位点的缺失效率也为100%，表明CRISPR-BhCas12b是细菌基因组编辑的潜在工具。

图 基于CRISPER-BhCas12b的B. subtilis基因缺失

为了构建失活的BhCas12b，研究人员根据AaCas12b、和BhCas12b的序列同源性鉴定了潜在的催化残基，以及分子动力学模拟以及分子对接策略，将失活的AacCas12b选择BhCas12b上的三个残基(D574、E828和D952)作为候选突变体。随后通过氨基酸突变鉴定CRISPR-BhCas12b缺失后活性，测试后发现BhCas12b(D574A/E828A/D952A)(简称dBhCas12b)完全丧失编辑效率。

图 BhCas12b关键催化残基的鉴定

利用改造的dBhCas12b与胞苷脱氨酶（PmCDA）进行联用构建CBE，设计并构建了四种CBE。构建策略为将CDA融合到dBhCas12b的N端并额外添加两个拷贝的UGI（CDA-dBhCas12b-UGI-UGI），使得能够在B. subtilis中诱导C到T的突变且编辑窗口约为16 nt。研究人员将改造后的腺苷脱氨酶ABE8e融合到dBhCas12b的N端构建ABE体系，数据表明ABE体系能高效实现A到G的突变，编辑窗口达到14 nt。此后，研究人员将新一代碱基编辑器应用于B. subtilis中RBS+Spacer的大窗口（15 nt）多样化中，通过构建RS组合突变文库，以最大程度调控基因的表达。

随后，研究人员测试了CBE是否可以在其他原核生物中起作用。与之前在微生物细胞中开发的CBE相比，基于dBhcas12b的CBE在超宽的编辑窗口内表现出较高的编辑效率，群体和单克隆测序结果均发现，新一代CBE的编辑窗口高达41~63 nt，大约是基于dCas9或ncas9的CBE的8倍。

图 基于dBhCas12b的CBE在大肠杆菌BL21 (DE3)中的功能表征

基于Cas12b的CBE构建，研究人员成功获得了一个基于dBhcas12b的BE，具有较高的转换效率和扩展的编辑窗口，不仅在B. subtilis中表现良好，也适用于E.coli。基于dBhcas12b的CBE能够诱导多达8个氨基酸转换，比理论上的BE要大几个数量级，被认为是具有扩展编辑窗口的新一代BE。

文章来源：基因编辑应用微信公众平台

论文链接：https://doi.org/10.1002/advs.202309767

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