分泌IL-15的CAR NK细胞靶向CD70，可消除癌细胞和癌症相关成纤维细胞
CAR-T细胞疗法在进行实体肿瘤治疗时，缺乏针对肿瘤组织的良好表面抗原。由于CD70在肿瘤细胞和癌症相关成纤维细胞（CAFs）上的特异性表达，因此CD70成为了CAR-T免疫疗法的理想靶点。此外，NK细胞作为CAR工程的替代平台也引起了广泛关注，因为CAR-NK细胞相比CAR-T细胞具有许多优势。除了具有更理想的治疗相关毒性特征外，CAR-NK细胞还可以作为现成的异体产品生产，从而缩短生产时间和降低成本，并且除了CAR介导的细胞毒性外，还具有内在的肿瘤杀伤能力。
2024年2月，比利时安特卫普大学医学与健康科学学院肿瘤学研究中心的Astrid Van den Eynde等研究者在Journal of Hematology & Oncology 杂志上发布了题为IL-15-secreting CAR natural killer cells directed toward the pan-cancer target CD70 eliminate both cancer cells and cancer-associated fibroblasts 的文章，验证并确定了CD70是结直肠癌（CRC）和胰腺癌（PDAC）患者肿瘤细胞和癌症相关成纤维细胞（CAFs）的有效靶点，对CD70导向的嵌合抗原受体（CAR）NK细胞的功能进行评估，发现IL-15刺激对于有效消除CD70+肿瘤细胞和CAFs至关重要，并且可以改善携带CD70+肿瘤的小鼠的肿瘤负担和存活率。
CD70：一个优秀的实体肿瘤治疗靶点
研究人员通过cBioPortal for Cancer Genomics platform (https://www.cbioportal.org)平台下载癌症基因组图谱(TCGA)，其中包含28种不同类型癌症的泛癌全基因组批量RNA-seq数据。数据显示，不同癌症中，CD70的mRNA表达水平各不相同（图1A）。根据过往研究发现：CD70在肿瘤微环境的CAFs中表达更丰富，而非肿瘤细胞中。由于PDAC的特点是含有大量CAFs，因此研究人员推测PDAC患者中也可能存在表达CD70的CAFs。通过使用已发表的基因集来识别一般CAFs和与免疫检查点阻断(ICB)治疗耐药相关的CAFs，估计其在CRC患者(即COAD/READ)和PDAC患者(即PAAD)中的数量。线性回归分析表明：两组CAFs均显示与CD70 mRNA的表达相关，尤其是在COAD和PAAD中(图1B, C)。在所有三个数据集中，与单独预测一般CAFs的单变量模型相比，包含一般CAFs和与ICB治疗耐药相关的CAFs估计值的多变量模型在预测CD70 mRNA表达方面表现更好(图1D)，但仅在COAD中达到显著性。
图1 CD70在CRC和PDAC患者中的表达水平(A—D)
另外，在蛋白质水平上也证实了在PDAC患者肿瘤微环境CAFs中的CD70表达(图1E、F、G)。在总队列中，65%的患者（15/23）表达CD70+ CAFs，其中CD70+ CAFs大量存在（即1—5%）的患者占34.8%（8/23），而CD70+ CAFs非常高（即>5%）的患者占17.4%（4/23）。以上与文献报道的一致，除少数活化的肿瘤浸润淋巴细胞外，在肿瘤微环境中未发现其他类型的细胞呈CD70阳性。此外，健康供者的外周血单核细胞(PBMCs)在循环CD4+和CD8+ T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞上显示CD70表达量低甚至无表达，突显出健康组织上CD70表达的有限性。
图1 CD70在CRC和PDAC患者中的表达水平(E—G)
CD70-CAR NK细胞对CD70高表达的肿瘤细胞表现出有活性的抗原特异性溶解
研究人员假设CAR-NK细胞可以有效地消除表达CD70的肿瘤细胞和CAFs细胞，通过构建出CD70-CAR结构，利用电穿孔法将NK-92细胞导入CD70-CAR mRNA以获得CD70-CAR NK细胞(图2A)。结果显示，CD70-CAR NK细胞在电穿孔4h后，CD27达到最大表达量，24h后维持高表达，72h后达到基线时表达水平（图2B, C）。
图2 CD70-CAR NK细胞的开发和验证(A—D)
将CD70-CAR NK细胞与对NK细胞耐药的Raji细胞株（编者注：该细胞株常用于免疫学和肿瘤学研究，Raji细胞是一种来自Burkitt淋巴瘤的B细胞淋巴瘤细胞系）共同培养，以评估其靶向杀伤作用。结果显示CD70-CAR NK细胞确实能够以CAR介导的方式清除Raji细胞(图2D)。然后进一步评估了CD70-CAR NK细胞对三个＞95% CD70+的血液和实体瘤细胞系(Raji, PANC-1, LIM2099)的细胞毒性能力(图2E, F, G)，发现CD70-CAR NK细胞消除这三种细胞系的能力均显著优于MOCK对照细胞(图2H)，对CD70高表达的Raji细胞杀伤能力最强，而对CD70表达最低的LIM2099细胞杀伤作用有限(图2I)。
图2 CD70-CAR NK细胞的开发和验证(E—I)
这些发现表明：CD70-CAR NK细胞能够杀伤抗原特异的CD70+肿瘤细胞，但只有在CD70抗原大量表达的情况下才能实现有效的消除。
IL-15可增强CD70CAR NK细胞的功能
为证明细胞因子在调节NK细胞功能中发挥着重要作用，研究人员将CD70-CAR NK细胞与之前描述用于提高CAR-T或NK细胞产品效力的细胞因子(IL-2、IL-7、IL-12、IL-15和IL-18)一起培养过夜，并将其与CD70+肿瘤细胞系(Raji, PANC-1, LIM2099)共培养。结果发现，用IL-2或IL-15刺激后，对三种肿瘤细胞系的细胞毒性活动均显著增加(图3A)，其中IL-15作用最显著(图3B)。但单独使用IL-15刺激并不能改善NK细胞介导的杀伤作用，而需要CD70-CAR的同时存在(图3C)。外源性IL-15刺激也导致CD70-CAR+ NK细胞频率略升高，CAR表面密度几乎翻倍(图3D)。
图3 IL-15细胞因子刺激对CD70-CAR NK细胞功能的影响(A—D)
进一步，研究人员开发了第四代靶向CD70的CAR，该CAR在CD70-CAR mRNA构建物中纳入了IL-15细胞因子组件(图6E)，经验证后，与CD70-CAR构建物相比，CD70-CAR-IL-15构建物的CAR密度与外源性添加IL-15一致(图3F)。随着时间的推移，IL-15刺激甚至延长了NK细胞表达CD70-CAR的持续时间，CD70-CAR-IL-15 NK细胞培养上清液中可检测到低水平的IL-15，电穿孔后24h后达到峰值(图3G)。功能上，CD70-CAR-IL-15 NK细胞主要表现为CAR介导的对CD70+靶细胞的杀伤作用(图3H)。尽管研究人员只检测到低水平的IL-15，但CD70-CAR NK细胞的激活状态通过促炎细胞因子IFN-γ和TNF-α显著增强。有趣的是，相比CD70-CAR NK细胞，PD-1和LAG3（NK细胞因子产生的负调节剂）的表达在IL-15刺激下保持不变，这种增强的激活状态也转化为对CD70+肿瘤细胞系的杀伤能力提高(图3J)。事实上，通过线性回归分析表明，与常规CD70-CAR NK细胞(图2I)相比，CD70-CAR-IL-15 NK细胞的杀伤活性对CD70靶标密度的依赖性更小(图3K)。此外，CD70-CAR-IL-15 NK细胞产生的IL-15具有(部分)自分泌或细胞内作用模式。而CD70-CAR-IL-15细胞在大量外源性IL-15刺激下，其CAR表达和杀伤能力与CD70-CAR-IL-15细胞相比差异无统计学意义。在CD70-CAR-IL-15 NK细胞中加入与CD70-CAR-IL-15分泌量相同的IL-15后，CD70-CAR- NK细胞的CAR密度和靶细胞杀伤能力显著降低。
图3 IL-15细胞因子刺激对CD70-CAR NK细胞功能的影响(F—K)
IL-15可帮助维持体内CD70-CAR疗效
为验证CD70-CAR-IL-15 NK细胞是否在全身环境中具有改善的功能，研究人员利用NSG小鼠进行皮下异种移植，建立CD70+Raji小鼠模型(图4A, B)。注射后，接受（CAR）NK细胞治疗的小鼠组出现了体重短暂下降的情况，但迅速恢复到基线水平。与未治疗对照组相比的，三种NK细胞疗法（MOCK, CD70-CAR, CD70-CAR-IL-15）均显著延缓了肿瘤的生长，并提高了生存期（图4C—E）。其中，与MOCK NK细胞治疗相比，使用CD70-CAR NK细胞的治疗在肿瘤生长或生存期方面并无显著差异（图4C, D）。因此，CD70-CAR NK细胞在体外对Raji细胞的毒性改善（图2D, E）并未在体内获得同样的效果。另外，与MOCK NK细胞相比，CD70-CAR-IL-15 NK细胞能显著降低肿瘤负荷，与常规CD70-CAR NK细胞相比，随时间推移呈降低趋势(在治疗后第20、21和22天效果显著；如图4C)。与肿瘤动力学一致，CD70-CAR-IL-15 NK细胞显著改善了小鼠的生存率(图4D)。
图4 CD70+raji小鼠经CD70-CAR NK细胞和CD70-CAR-IL-15 NK细胞治疗后的肿瘤动力学和生存情况
携带IL-15的CD70-CAR NK细胞能有效清除CD70+ CAFs
鉴于CD70+ CAFs的促肿瘤性质，研究人员将来自胰腺癌(PDAC)患者（即RLT-PSC和hPSC21）和结肠癌(CRC)患者（即CT5.3hTERT, 图5A—C）的CD70+永生化CAF细胞系与CD70-CAR NK细胞、CD70-CAR-IL-15 NK细胞或MOCK NK细胞共培养，并使用xCELLigence RTCA系统监测CAF细胞的存活情况。与肿瘤细胞的体外数据一致，CD70-CAR NK细胞在三种CAF细胞系中均显示出比MOCK NK细胞有更强的抑制CAF生长的能力。与CD70-CAR NK细胞相比，CD70-CAR-IL-15 NK细胞在完全清除CD70+ PDA CRC CAFs方面表现出更强的效力（图5D）。
图5 CD70-CAR NK细胞和CD70-CAR-IL-15 NK细胞对CD70+CAFs的杀伤活性(A—E)
这些结果在由三名不同胰腺癌患者来源的类器官（P002、P044、P087）与CD70+ RLT-PSC CAFs共同建立的3D微肿瘤模型中得到验证。类器官与红色荧光标记的RLT-PSC细胞共同培养以形成微肿瘤，并在两天后用MOCK NK细胞、CD70-CAR NK细胞、CD70-CAR-IL-15 NK细胞处理或不做处理。随后，使用Spark Cyto多功能微孔板检测仪监测红色荧光信号的变化（图5E）。将明场成像与红色荧光信号叠加分析发现，经MOCK NK细胞疗法和CD70-CAR NK细胞疗法与三名患者的微肿瘤接触后，只能略微减缓CAF的生长。相比之下，CD70-CAR-IL-15 NK细胞与胰腺癌微肿瘤接触后，CAF生长速率随时间显著减缓（图5G, H）。对治疗后不同时间点的CAF标准化生长速率进行量化发现，与对照相比，CD70-CAR NK细胞在大多数时间点对CAF作用轻微，未达到显著水平。值得注意的是，与MOCK NK细胞和CD70-CAR NK细胞相比，CD70-CAR-IL-15 NK细胞在所有时间点均显著减缓了CAF的生长速率。
图5 CD70-CAR NK细胞和CD70-CAR-IL-15 NK细胞对CD70+CAFs的杀伤活性(F, G)
总结
综上所述，研究人员证明了CD70在CRC和PDAC患者中对靶向肿瘤细胞和促进肿瘤的CAFs具有巨大的治疗潜力。此外，用IL-15包裹CD70-CAR NK细胞能有效清除CD70+肿瘤细胞和CAFs。在机制上，IL-15促进了CD70-CAR的表达，并增强了CD70-CAR NK细胞的活化状态。总之，这些结果为将CD70-CAR-IL-15 NK细胞转化到临床提供了强有力的理论基础，从而改善CRC和PDAC患者的最终治疗效果，以及可能的其他以促结缔组织增生反应为特征的肿瘤类型。
文章来源：细胞知聊微信公众平台
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